自噬的分子標(biāo)志物研究論文

　　在生理狀態(tài)下, 細(xì)胞通過自噬 (autophagy) 清除衰老細(xì)胞器和突變蛋白, 以維持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能正常。自噬還參與胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等生理過程。病理狀態(tài)下細(xì)胞自噬水平顯著升高, 以耐受缺血、饑餓和凋亡等情況。此外, 自噬功能的障礙還會導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運送到溶酶體腔的方式不同, 自噬可分為大自噬 (macroautophagy)、小自噬 (microautophagy) 、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperon-mediated autophagy, CMA)。此外, 還有些選擇性自噬如線粒體自噬 (mitophagy)、聚集體自噬 (aggrephagy)等。不同類型的自噬其發(fā)生過程不同,參與的蛋白分子也不同。檢測不同自噬過程中的分子標(biāo)志物的水平、狀態(tài)與定位有助于評價細(xì)胞的自噬水平。

　　1 大自噬標(biāo)志物

　　大自噬的囊泡膜結(jié)構(gòu)起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等。這些膜片段形成杯狀結(jié)構(gòu), 包裹胞內(nèi)物質(zhì)并最終形成閉合的雙層膜的囊泡即自噬體, 然后自噬體與溶酶體融合, 自噬體內(nèi)蛋白質(zhì)或細(xì)胞器在溶酶體中被溶酶體酶降解。因此該過程的標(biāo)志物包括自噬體囊泡形成過程的標(biāo)志物、溶酶體標(biāo)志物和自噬底物標(biāo)志物三類。

　　1.1 自噬體標(biāo)志物

　　自噬相關(guān)蛋白 (autophagy-related protein, Atg)是一類自噬組成蛋白, 參與調(diào)節(jié)自噬起始和延伸等過程。其中幾個關(guān)鍵蛋白, 也成為自噬標(biāo)志物。

　　1.1.1 Atg12-Atg5 復(fù)合物Atg12 與Atg5 會形成復(fù)合物, 甚至在一些哺乳動物細(xì)胞中似乎所有Atg5和Atg12都表現(xiàn)為結(jié)合體的形式。Atg12-Atg5 復(fù)合物在自噬的形成中至關(guān)重要。此外, Atg12-Atg5 復(fù)合物還可以充當(dāng)Atg8-磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,PE) 結(jié)合系統(tǒng)的E3 樣連接酶。Atg12-Atg5 的缺失會導(dǎo)致自噬缺陷。但在短時饑餓狀態(tài), Atg12-Atg5 的水平改變并不明顯。Atg12-Atg5 復(fù)合物的水平檢測可采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù) (Western blot) 方法進(jìn)行。Atg12 分子質(zhì)量預(yù)期為15 kDa, 但在SDS-PAGE 膠上目測大約在19 kDa的位置上。Atg5 分子質(zhì)量大約為32 kDa。由于Atg12分子質(zhì)量小, 不易檢測, 并且Atg5 與Atg12 的結(jié)合是非可逆的, 因此可分別用Atg5 和Atg12 的抗體孵育,然后直接檢測Atg12-Atg5 的結(jié)合形式, 其分子質(zhì)量大約在55 kDa 左右。

　　1.1.2 自噬相關(guān)16 樣蛋白1 (autophagy related 16-like 1, Atg16L1) Atg16L1 與Atg12-Atg5 復(fù)合物相互作用, 并以自身寡聚化的方式形成Atg12-Atg5-Atg16L1 復(fù)合物 , 附著在自噬體表面, 在自噬前體膜的延伸中發(fā)揮作用。在自噬前體膜完全融合形成封閉的自噬體后, Atg12-Atg5-Atg16L1 復(fù)合物被釋放到胞質(zhì)中。在細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移作為自噬膜供體的過程中, Atg16L1 可作為一個指標(biāo), 其定位在自噬體上,但在完整的自噬溶酶體膜上尚未見分布。因此,Atg16L1 可以用來檢測早期自噬體的形成。可對Atg5、Atg12 或Atg16L1 進(jìn)行免疫透射電鏡和免疫染色的檢測。檢測內(nèi)源性的Atg5、Atg12 或Atg16L1 所形成的點狀聚集或斑塊可監(jiān)測自噬的改變。在生理情況下, 內(nèi)源性蛋白主要是在胞漿中彌散分布的; 而在饑餓等環(huán)境應(yīng)激下自噬被誘導(dǎo), 則細(xì)胞中Atg5、Atg12 或Atg16L1 的點狀聚集或斑塊會明顯增加。

　　1.1.3 Atg8/微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 (microtubuleassociatedprotein1 light chain 3, LC3) Atg8/LC3是目前研究中被最廣泛使用的分子標(biāo)志物。在酵母中, Atg8 與PE 偶聯(lián)形成Atg8-PE[5]。LC3 參與了自噬體膜的形成, 包括兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式即LC3-I 和LC3-II。細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3 經(jīng)過加工, 成為胞漿可溶形式的LC3-I, 后者經(jīng)泛素化加工修飾, 與自噬體膜表面的PE 結(jié)合, 成為膜結(jié)合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體, 是自噬體的標(biāo)志分子, 隨自噬體膜的增多而增加。SDS-PAGE 電泳中, LC3-I 的表觀分子質(zhì)量為18 kDa, LC3-II 的表觀分子質(zhì)量為16 kDa。盡管PE偶聯(lián)形式的LC3-II 的分子質(zhì)量較LC3-I 大, 但是其具有強(qiáng)疏水性, 因此在SDS-PAGE 中電泳遷移率反而比LC3-I (非PE 偶聯(lián)的LC3) 快。可以通過Western blot比較組間LC3-II 水平, 也可通過計算LC3-II/LC3-I的比值來評價LC3-II 水平, 并推測自噬囊泡數(shù)量的多少。LC3 在含SDS 的樣品裂解液中易降解, 因此樣品經(jīng)煮沸裂解后應(yīng)當(dāng)盡快進(jìn)行Western blot 實驗, 并避免反復(fù)凍融。LC3-II 的含量或LC3-II/LC3-I 的比例與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān), 在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。但是需要注意的是, 自噬是動態(tài)的, 自噬體的聚集可能是自噬活化待降解底物聚集而成, 也可能是自噬效應(yīng)部分阻斷, 自噬體無法被清除導(dǎo)致的。因此僅評價自噬體數(shù)量或LC3-II 的表達(dá)均不能代表整個自噬過程。只有客觀地分析自噬動態(tài)變化才能準(zhǔn)確地判斷自噬活性。基于自噬流 (autophagic flux) 的檢測成為反映自噬活性更為可靠的指標(biāo)。

　　1.1.4 Atg9/mAtg9 Atg9 是所有Atg 蛋白中唯一的跨膜蛋白, 進(jìn)化上高度保守, 在酵母以及哺乳動物細(xì)胞中都存在。酵母Atg9 存在于30～60 nm 的、來源于高爾基體膜的單層囊泡上, 這些Atg9 囊泡在胞漿快速運動, 并整合到自噬囊泡外膜上。哺乳動物細(xì)胞mAtg9 與自噬囊泡存在動態(tài)相互作用。在形成成熟自噬體后, mAtg9 并未整合進(jìn)自噬體囊泡上, 而是又游離進(jìn)入胞漿。有研究表明, mAtg9 在形成雙FYVE 結(jié)構(gòu)域蛋白1 (double FYVE-containing protein 1, DFCP1)陽性的自噬體前體中是必需的, 但不依賴于早期的一些自噬蛋白如UNC-51 樣激酶1 (UNC-51-like kinase1, ULK1) 和磷酸肌醇相互作用蛋白2 (WD repeatdomain, phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)。mAtg9 定位在內(nèi)體和內(nèi)體樣的部位, 推測其在多種細(xì)胞器如再循環(huán)的內(nèi)體間活動, 在自噬的起始進(jìn)程中發(fā)揮極為關(guān)鍵的作用。mAtg9 可用來檢測自噬的發(fā)生。

　　1.1.5 Atg6/Beclin1 哺乳動物Beclin1 是酵母Atg6/液泡分選蛋白30 (vacuole protein sorting 30,Vps30) 基因的同源物。Beclin1 主要定位于反面高爾基體 (trans-Golgi network, TGN)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。Beclin1 與Vps34 形成III 型磷脂酰肌醇3 激酶復(fù)合物 (phosphatidylinositol 3-kinase Class IIIcomplex, PI3KC3) 。Vps34 可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3-phosphate, PI3P), 而PI3P 募集胞漿中其他自噬相關(guān)蛋白Atg 結(jié)合到前自噬體膜上, 在自噬體形成早期發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抑制劑可干擾自噬體的形成。此外, Bcl-2 與Beclin1 結(jié)合也可抑制自噬活性。用熒光顯微鏡或透射電鏡可檢測Beclin1-GFP 的點狀聚集或斑塊作為自噬標(biāo)志物。但Beclin1 自身有核定位信號, 且GFP 融合蛋白的定位受到GFP 的干擾, 因此Beclin1-GFP 熒光顯微結(jié)果顯示有核定位傾向, 可能會影響對自噬狀態(tài)的評判。在Beclin1 依賴的自噬中, PI3K 活性在自噬體形成中至關(guān)重要, 因此在Beclin1 免疫沉淀物中測定PI3K 活性可用來監(jiān)測其對自噬的調(diào)節(jié)影響。

　　1.1.6 Atg14/Barkor Atg14 定位在自噬體上, 其羧基端被命名為BATS (barkor autophagosome targetingsequence) 區(qū)域。BATS 區(qū)域在Beclin1 招募和自噬活化中意義重大。Atg14 的BATS 區(qū)域通過α 螺旋的疏水表面與自噬囊泡膜結(jié)合。在應(yīng)激情況下, BATS 點狀聚集或斑塊與Atg16 和LC3 以及部分自噬早期標(biāo)志物DFCP1 重合。Atg14-GFP 或BATS-GFP 在用熒光顯微鏡或投射電鏡技術(shù)檢測自噬水平時可作為自噬標(biāo)志物。但除了定位于自噬體, Atg14 也定位于自噬溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。因此, 用Atg14 作為標(biāo)志物時最好也結(jié)合用其他自噬標(biāo)志物做鑒定。

　　1.1.7 損傷調(diào)節(jié)自噬蛋白 (damage-regulated autophagymodulator 1, DRAM1) DRAM1 是一個具有六個跨膜結(jié)構(gòu)的疏水蛋白。除了定位于順面高爾基體, DRAM1 也定位于早期和晚期內(nèi)體和溶酶體, 它與早期核內(nèi)體相關(guān)蛋白1 (early-endosome-associatedprotein 1, EEA1) 和溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (lysosomeassociatedmembrane protein type 2, LAMP-2) 共定位。在應(yīng)激情況下, DRAM1 可被活化的p53 激活。DRAM1 基因沉默會阻斷自噬的發(fā)生。由于DRAM1分子質(zhì)量很小, 大約28 kDa, 加之其疏水性強(qiáng), 蛋白水平檢測有一定難度, 可考慮用實時定量PCR 對其mRNA 水平進(jìn)行檢測。

　　1.1.8 ZFYVE1/DFCP1 鋅指FYVE 結(jié)構(gòu)域蛋白1(zinc finger FYVE domain-containing protein 1, ZFYVE1)也被稱為雙FYVE 結(jié)構(gòu)域蛋白1 (DFCP1), 其羧基端即為兩個鋅結(jié)合的FYVE 結(jié)構(gòu)域。FYVE 結(jié)構(gòu)域參與膜轉(zhuǎn)運和細(xì)胞信號, 促進(jìn)其與含PI3P 的膜結(jié)合。ZFYVE1/DFCP1 與PI3P 結(jié)合后, 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。饑餓誘導(dǎo)DFCP1 轉(zhuǎn)位至粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的粗粒上, 顯示在歐米茄體 (omegasome) 形成的部位。因此DFCP1 可作為自噬形成初期的標(biāo)志物。DFCP1的表達(dá)可用熒光免疫組化方法觀察, 出現(xiàn)DFCP1 陽性的點狀分布則意味著自噬囊泡正在開始形成期。

　　1.2 溶酶體標(biāo)志物

　　因為自噬過程最終的完成是在溶酶體中進(jìn)行的,因此溶酶體標(biāo)志蛋白在自噬功能研究中就顯得極為重要。在酸性水解酶的作用下, 進(jìn)入溶酶體的自噬體內(nèi)容物被降解。降解生成的可溶性小分子物質(zhì)經(jīng)自噬溶酶體膜滲透入細(xì)胞質(zhì), 參與細(xì)胞的物質(zhì)代謝活動。目前已識別的25 個溶酶體膜蛋白都是高糖基化的。含量最高的膜蛋白就是溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP-1)、LAMP-2 和溶酶體整合膜蛋白 (lysosomal integralmembrane protein, LIMP-2)。可用免疫組化或Western blot 的方法檢測溶酶體重要膜蛋白的水平,并與其他自噬相關(guān)蛋白結(jié)合使用。

　　1.3 自噬底物

　　p62 也被稱為SQSTM1, 在多種細(xì)胞和組織中都有表達(dá), 可作為一個貨車蛋白參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。p62 可連接LC3 和泛素化的底物, 隨后被整合到自噬體中, 并在自噬溶酶體中被降解。當(dāng)自噬被激活時自噬體與溶酶體融合, 自噬囊泡中p62 等蛋白或細(xì)胞器被溶酶體酶降解, p62 水平降低; 當(dāng)自噬被抑制時自噬體積累, p62 水平升高。因此, 可以用Western blot 方法檢測p62 的水平, 作為自噬能力變化的指征。

　　除了與LC3 和泛素化蛋白結(jié)合外, p62 可能還參與形成雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物 (target of rapamycincomplex 1, TORC1)。p62 還與蛋白酶體功能相關(guān)。當(dāng)?shù)鞍酌阁w功能被抑制時, p62 水平也會增高。此外,p62 也是鈣依賴的非溶酶體蛋白酶calpain 1 的底物,因此很難解釋它在自噬與死亡檢測中的意義。在自噬被激活時, LC3 的上調(diào)和p62 的表達(dá)下降不一定有明顯的關(guān)聯(lián)。盡管p62 可以作為自噬損害或者自噬流改變的輔助標(biāo)志, 但最好聯(lián)合其他指標(biāo)如LC3 進(jìn)行自噬流的評估。

　　2 CMA 的標(biāo)志物

　　CMA 是胞漿內(nèi)某些蛋白質(zhì)被分子伴侶如熱休克蛋白質(zhì)70 (heat shock cognate protein of 70 kDa,HSC70) 識別, 并將其運送到溶酶體膜上, 再經(jīng)溶酶體膜蛋白LAMP-2a 結(jié)合后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化的過程。與大自噬和小自噬相比,CMA 的主要特點是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)直接經(jīng)溶酶體膜蛋白轉(zhuǎn)運入溶酶體腔, 不需形成自噬囊泡。

　　2.1 HSC70

　　HSC70 是分子質(zhì)量為70 kDa 的熱休克同源蛋白,它是分子伴侶, 在胞漿識別帶有KFERQ 樣序列的CMA 底物。HSC70 與定位于溶酶體腔面的Hsp90 相互作用。在HSC70 的幫助下, 底物在穿越溶酶體膜時開始從折疊狀態(tài)去折疊, 并在LAMP-2a 復(fù)合物形成之前完成。將底物轉(zhuǎn)運穿越溶酶體膜還需要定位在溶酶體膜上的HSC70 (lys-HSC70)。HSC70 的穩(wěn)定性依賴于溶酶體的pH 值。pH 值輕微的上升都會促進(jìn)HSC70 的降解。

　　2.2 LAMP-2a

　　LAMP-2 有3 個亞型, LAMP-2a、LAMP-2b 和LAMP-2c, 借助RNAi 技術(shù)顯示只有LAMP-2a 才是CMA 途徑重要的受體。CMA 的速率直接依賴于溶酶體膜上LAMP-2a 的含量。LAMP-2a 在胞內(nèi)的水平可由于轉(zhuǎn)錄水平改變或降解速率改變而發(fā)生變化。抑制LAMP-2a 將引起CMA 底物GAPDH 的聚集; 過表達(dá)LAMP-2a, 則引起GAPDH 水平下降。

　　3 線粒體自噬標(biāo)志物

　　線粒體自噬指在ROS、營養(yǎng)缺乏和細(xì)胞衰老等內(nèi)外環(huán)境的刺激下, 細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化, 而這些被損傷的線粒體將被特異性地包裹進(jìn)自噬體中并與溶酶體融合, 從而完成損傷線粒體的降解, 維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程。細(xì)胞主要通過選擇性自噬來進(jìn)行線粒體的更新。損傷的線粒體在發(fā)生線粒體自噬之前先發(fā)生動力相關(guān)蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介導(dǎo)的線粒體分裂。線粒體膜電位的下降引起PTEN 誘導(dǎo)假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-inducedputative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接著招募E3 泛素連接酶Parkin 到線粒體。Parkin 促進(jìn)線粒體膜上蛋白質(zhì)泛素化, p62 蛋白與線粒體上泛素化蛋白相互作用,借助p62 與LC3 的互作引導(dǎo)線粒體被自噬體包裹。同時, 線粒體上存在自噬受體如BNIP3 (Bcl-2 andadenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/BNIP3L (BNIP3-like) 也可以與LC3 互作使得受損線粒體通過自噬方式被去除。研究中通常用線粒體標(biāo)志物和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3共定位來顯示線粒體自噬。此外, 還有幾個線粒體自噬受體也可以考慮用作線粒體自噬的標(biāo)志。

　　3.1 Atg32

　　酵母中, Atg32 是一個分子質(zhì)量約59 kDa 的跨膜蛋白, 定位在線粒體外膜上。在氨基端有與Atg8 和Atg11 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域, 在線粒體自噬的發(fā)生中作用巨大。Atg11 是個腳手架蛋白, 在選擇性自噬中為Atg蛋白的裝配提供平臺。羧基端可能發(fā)揮調(diào)節(jié)線粒體自噬的作用。抑制Atg32 表達(dá)會減少線粒體自噬的效率,同樣地, 過表達(dá)Atg32 則增加線粒體自噬的效率。研究認(rèn)為Atg32 是酵母線粒體自噬發(fā)生的限速步驟。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)酵母中Atg32 缺失并不明顯影響普遍意義上的自噬, 因此認(rèn)為Atg32 是引導(dǎo)線粒體自噬專屬分子。盡管線粒體自噬是進(jìn)化上保守的現(xiàn)象,但是在哺乳動物細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn)Atg32 的同源基因。

　　3.2 BNIP3 和NIX

　　BNIP3 和NIX 序列上有56% 的同源度, 且都有BH3 結(jié)構(gòu)域, 并與Bcl-2 作用。NIX 與BNIP3 定位在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 通過影響線粒體呼吸和ROS 水平調(diào)節(jié)凋亡和程序性壞死。BNIP3 插入線粒體的外層膜,其氨基端在胞漿中, 而羧基端在線粒體內(nèi)。BNIP3 誘導(dǎo)線粒體嵴消失并促進(jìn)細(xì)胞色素C 釋放, 同時, NIX和BNIP3 包含有與LC3 結(jié)合的LC3 相互作用區(qū)域(LC3-interaction region, LIR), 因而也被稱為是線粒體自噬受體。BNIP3 的17 位絲氨酸和24 位絲氨酸的磷酸化會促進(jìn)其與LC3 結(jié)合, 易化線粒體自噬的發(fā)生。NIX 與Ras 家族小GTPase—Rheb 互作促進(jìn)線粒體自噬。此外, NIX 可促進(jìn)Parkin 定位到受損線粒體上, Parkin 又對線粒體膜上蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化, 從而引導(dǎo)p62 與LC3 的互作而發(fā)生線粒體自噬。

　　4 小結(jié)

　　自噬標(biāo)志物的檢測在自噬研究中發(fā)揮了巨大的作用, 使得人們可以簡便、動態(tài)、實時并定量地檢測細(xì)胞內(nèi)自噬水平。然而單獨檢測每一種自噬標(biāo)志物都有一定的局限性和影響因素, 在研究自噬時必須慎重考慮研究條件, 適當(dāng)設(shè)置陰性與陽性對照, 使用多種自噬抑制劑或者基因沉默等技術(shù), 多方面、多層次進(jìn)行實驗以確認(rèn)細(xì)胞的自噬水平。

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