實時熒光定量PCR研究進展及其在中藥領域的實踐的論文
1993 年，Higuchi 等人將PCR 技術和封閉式檢測相結合，對目的核酸數量進行定量分析，提出了熒光定量PCR 技術的概念。1995 年美國PE 公司成功研制了TaqMan 技術，1996 年又推出了首臺熒光定量PCR 檢測系統，通過檢測每個循環的熒光強度，并使用Ct值進行分析，達到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR 技術才得以真正的推廣和應用。到目前為止，實時熒光定量已被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等科學領域。
1 原理
Real-Time PCR 是在PCR 反應體系中加入熒光物質，利用熒光信號對整個PCR 進程進行實時監測，從而達到對未知起始模板進行定量分析的目的。它是一種將酶動力學、核酸擴增、光譜分析和實時檢測技術相結合的技術。隨著PCR 反應的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光信號，這樣就可以通過熒光信號強度變化實時監測PCR 產物量的變化，從而得到一條描述PCR 動態進程的曲線，即擴增曲線。
實 時熒光定量PCR 擴增曲線可以分為4 個階段: 基線期、早期指數期、對數-線性期和平臺期，見圖1。在基線期( 通常1 ～ 15 個循環) ，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化; 早期指數期，熒光信號超過背景信號并到達閾值( 通常為基線信號標準偏差的10 倍) ，此時循環數稱為Ct( Cycle threshold) 值或Cp( Crossingpoint) 值，Ct值與模板起始濃度的對數值成反比線性關系，因而Ct值可被用來定量模板起始濃度; 對數-線性期，在理想反應條件下每經歷一個循環，PCR 產物加倍; 平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR 產物量不能計算出起始模板拷貝數。實時熒光定量PCR 能準確地確定初始模板拷貝數，結果重現性好，誤差小，與常規PCR 在終點定量上相比更具重要意義。實時熒光定量PCR 結果不僅可以定性( 判斷一段序列的存在與否) ，還可定量( 確定基因的拷貝數) ，而常規PCR 只能做到半定量。另外，實時熒光定量PCR 的反應和檢測都是在封閉的反應管中進行的，樣品污染幾率大大降低，無需擴增后的實驗操作，大大節省了實驗時間，提高了實驗效率。
2 Real-Time PCR 定量類型
實時熒光定量分析包括絕對定量和相對定量。絕對定量是對未知樣品絕對拷貝數進行測定的方法;相對定量不是測定樣品的絕對拷貝數，而是比較樣品之間同一目的基因的相對表達量，以期分析樣品之間目的基因的表達差異。
2. 1 絕對定量
絕對定量是使用一系列已知濃度( 通常為5 ～ 6個梯度稀釋的濃度) 的標準品繪制標準曲線，建立Ct值與起始模板量[總核糖核酸( RNA) 或脫氧核糖核酸( DNA) ] 的對數值之間的線性關系，達到對未知樣品絕對的定量。標準曲線的繪制首先是標準品的選擇，標準品可以是DNA( 重組質粒DNA、基因組DNA、純化的RT-PCR 產物及合成的寡核苷酸DNA) 或RNA( 體外轉錄RNA[5，8-10]) 。但是為了保持與待測樣品間擴增效率的一致性，標準品應盡量選擇與待測樣品結構近似的樣品，該方法要求梯度稀釋的標準品都必須與待測樣品同時平行擴增，且待測樣品濃度應包含在已知標準品濃度范圍之內。
2. 2 相對定量
相對定量解析方法相對復雜，一般用于基因表達分析。根據選用的標準不同可分為以質量單位為標準的相對定量和以內參基因為標準的相對定量。以質量單位( 細胞的數目或核酸的微克數) 作為標準的相對定量優點是實驗設計概念簡單，數據分析處理簡單易學，缺點是很難準確量化初始材料; 而以內參基因作為標準的相對定量優點是能準確量化初始材料的載量，尤其當初始材料受限時，進行相對表達分析十分方便。缺點是要求得到一個或多個在所有待測樣本中恒定表達的內參基因。目前，使用較多的是以內參基因作為標準的定量方法。
2. 2. 1 內參基因的穩定性評價為了確保定量結果的可靠性和準確性，在qRT-PCR 中需選擇合適的內參基因對不同樣品之間因質量、RNA 的提取效率以及反轉錄效率不同所產生的差異進行校正，從而實現對不同樣品中RNA 的定量和數據歸一化。理想的內參基因應滿足以下條件: 1) 在不同發育階段和不同組織器官中表達穩定; 2) 表達不受生物學、實驗條件的影響; 3) 其穩定的表達水平與目的基因表達水平相近。在植物qRT-PCR 研究中用的最多的內參基因通常是看家基因( housekeepinggenes) ，然而越來越多的`研究表明，看家基因在不同類型細胞和不同生理狀態下的表達并不是恒定不變的，若盲目選擇看家基因作為內參，可能會導致基因表達分析結果不準確，甚至得到相反的或者錯誤的結論。因此選擇合適的、穩定的內參用于基因表達的差異分析非常關鍵。目前，geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT等分析方法被廣泛用于內參基因的篩選與評價。Xie 等將上述4 種方法整合成一個在線的分析工具—RefFinder，用于各種實驗條件下內參的篩選，避免了單個分析方法的片面性。
2. 2. 2 引物的特異性及擴增效率的檢測為了使結果準確可靠，qRT-PCR 中還要求引物的特異性好，擴增效率接近100%。劉正霞等研究顯示，引物的特異性和擴增效率對定量PCR 結果分析有顯著影響。
引物的特異性評估: 引物的特異性可以通過凝膠電泳、PCR 產物克隆測序以及qRT-PCR 的熔解曲線來檢查。凝膠電泳的條帶若為單一條帶，則說明PCR 產物特異性好，若有多條則說明特異性差，需要優化PCR 反應條件和體系或重新設計引物; PCR產物克隆測序結果在去除載體序列后與原序列進行比對，分析測得的序列是否位于上下游引物之間;在qRT-PCR 中，可以通過熔解曲線來判斷引物的特異性，若熔解曲線為單峰則說明引物的特異性好。通過上述3 種方法均可以對設計的引物進行特異性檢測，以便篩選特異性較好的引物進行后續實驗。擴增效率的計算: 相對定量結果的準確性還受到目的基因和內參基因的PCR 擴增效率影響。一般來說，擴增效率接近100%是優化實驗使得結果重復性好且可靠的最好標志。實際操作時，反應的擴增效率應該在90% ～ 105%之間，如果擴增效率低，可能原因是引物設計不佳，或是反應的條件沒有優化;擴增效率大于100%時，可能的原因有非特異性產物擴增，如引物二聚體、錯配等引起的PCR 產物產生。傳統計算擴增效率的方法是將已知模板稀釋成一系列梯度濃度( 不少于5 個點) ，并進行實時熒光定量PCR 實驗，利用拷貝數的對數值和Ct值建立標準曲線。評價標準曲線的優劣有兩個指標，相關系數( r) 和斜率。相關系數反映標準曲線的直線性，越接近1 說明直線性越好，定量越精確; 斜率與擴增效率相關，計算公式: 擴增效率( E) = 10( - 1 /斜率) - 1。在PCR 過程中，擴增效率在指數期相對穩定，但是隨著循環數的增加，Taq 酶、脫氧核糖核苷三磷酸( dNTP) 、引物，甚至DNA 模板等各種PCR 要素逐漸不敷需求，擴增效率也就越來越趨向于0。通過標準曲線得出的擴增效率不能反映PCR 進程中擴增效率的變化。由于PCR 結果往往是通過Ct值來計算的，由擴增效率引起的最終差異只能反映在Ct值上的變化。
為了減小這種情況引起的誤差，在定量時確保各樣品濃度值在一系列梯度濃度的范圍內，即Ct值在標準曲線范圍內。此外，尚有根據PCR 進程中的原始數據或擴增曲線的形狀，再基于不同的數學算法開發出來的一些軟件來計算擴增效率的。這些算法或軟件使得擴增效率的計算更加簡單易行，特別是對于那些表達量很低的基因很難通過一系列的梯度稀釋來求擴增效率。該方法缺點是不同軟件基于的算法不同，因此各軟件得到的結果也有差異; 噪音導致可用的數據點很有限，計算的擴增效率也就不精確。
2. 2. 3 數據處理方法對于不同的實驗需求，我們可以采用不同的方法進行實驗設計和數據分析，在這里只討論以內參基因為標準的相對定量方法。常用的方法有雙標準曲線法、2-△△Ct法、用參照基因的△Ct法和Pfaffi 法，應用每種方法必須對應適應的條件。雙標準曲線法: 首先分別對目的基因和看家基因的5 個( 盡量不少于5 個點) 濃度梯度稀釋的標準品制作兩條標準曲線。各待測樣品與標準品同時進行反應，得到目的基因的Ct值，分別代入目的基因的標準曲線，得到看家基因的Ct值，分別代入看家基因的標準曲線，這樣就可以換算出各待測樣品目的基因和看家基因的起始模板量。其次，利用內參對各待測樣品進行歸一化，即用目的基因的定量結果除以看家基因的定量結果。最后對不同樣品之間目的基因的表達量進行比較，通常將對照樣品的表達量作為1，計算出相對量，再進行樣品間相對量比較。2-△△Ct ( Livak) 法: 2-△△Ct 法是定量PCR 實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，但條件是目的基因和內參基因擴增效率都接近100%，且相互間效率偏差在5% 以內，否則會產生較大的誤差。
使用2-△△Ct 法之前，必須驗證目的基因和內參基因的擴增效率。其操作步驟如下: 首先，對所有的待測樣品和對照樣品，用內參基因的Ct值歸一化目的基因的Ct值: △Ct = Ct( 目的基因) - Ct( 內參基因) ; 其次，用對照樣品的△Ct值歸一化待測樣品的△Ct值: △△Ct =△Ct( 待測樣品) -△Ct( 對照樣品) ; 最后，計算表達水平比率: 表達量的比值= 2 -△△Ct。如果目的基因和內參基因有同樣的擴增效率，但是擴增效率不等于2，那么2 -△△Ct 法的公式可以修正為用實際擴增效率值代替等式中的2。如果目的基因和內參基因擴增效率不相近，可以優化或重新設計實驗。用參照基因的△Ct法: 用參照基因的△Ct法是2 -△△Ct法的一種變化形式，它更容易掌握且結果相同。與2 -△△Ct得到的△Ct值相比，△Ct法是每個樣本之間參照基因與目的基因的Ct值的差值。雖然這種方法的操作步驟簡單，但同樣也能真實衡量基因表達水平，將參照基因的表達水平計算在內。結果顯示，主要的差異是校準樣本的表達水平不是1。如果用這個方法得到的表達值除以所選的校準樣本的表達值，計算結果與2 -△△Ct 法的結果正好相同，即表達量的比值= 2( △Ct( 內參基因) -△Ct( 目的基因) )Pfaffi 法: 當目的基因和內參基因的擴增效率相近時，用2 -△△Ct法定量相對基因表達是最合適的方法，但是如果兩個擴增子擴增效率不同，必須選擇另一種方法來確定不同樣本之間目的基因的相對表達量。Pfaffi 法則是目前最好的選擇方法，計算公式為:表達量的比值= C( A - E) /D( F - B) ( C 和D 分別是目的基因和內參基因的擴增效率; A 和E 分別是對照樣品和待測樣品中目的基因的Ct值; F 和B 分別是待測樣品和對照樣品中內參基因的Ct值) 。
2. 2. 4 歸一化歸一化是對所有樣品之間的差異進行校正。不同的樣品，即使反應時使用相同量的總RNA，但因細胞來源不同，RNA 總表達量并非一致。因此僅僅將反應時RNA 量統一，起始的細胞數也不一定相同。其實在進行表達量分析時，比較的是相同數量細胞中的某個基因拷貝數目。實際上要將樣品材料統一到相同細胞數提取是非常困難的，同時還不能保證RNA 提取效率、反轉錄效率以及PCR 擴增效率完全相同。基于上述原因，在進行表達量分析時，有必要選擇內參基因對所有樣品進行歸一化處理，以獲得目的基因特異性表達的真正差異。
篩選出穩定的內參基因后，先對目的基因歸一化處理，然后進行表達差異分析。目前進行歸一化分析的方法有兩種: 單基因歸一化和多基因歸一化。實時熒光定量最早被用于基因表達差異分析時，大多文獻報道都是以單個基因作為內參基因，對目的基因的表達量進行歸一化。然而，基于單一內參基因進行歸一化存在許多缺點，可能導致比較大的誤差。因此，多個看家基因開始被應用于歸一化分析中。
3 在中藥領域中的應用
3. 1 基因表達分析
熒光定量PCR 最普遍的應用是基因表達分析。從基礎科學研究到實際應用，檢測基因表達都是基本的也是很重要的一項工作。Olofsson 等對黃花蒿不同組織中萜類代謝途徑上的基因進行表達差異分析，為評估青蒿素的前體對青蒿素產量的影響提供科學參考。植物在生物和非生物脅迫下，基因表達水平的相對變化與次生代謝產物累積相關性的研究越來越受到科研工作者的青睞。如Cheng 等用YE、Ag + 和MeJA 3 種誘導子組合誘導丹參毛狀根。結果發現，在處理24、36 h 后，SmCPS 的表達量顯著上調，次生代謝產物隱丹參酮和二氫丹參酮Ⅰ的含量也隨之顯著上升，這表明丹參酮類化合物含量的升高可能與SmCPS 基因表達量的上調有關。在植物的不同發育階段，其次生代謝產物的累積量及基因的表達水平也會不同。如Kim 等對人參在葉片不同開放期( 閉合階段、中間階段、全開放階段) 其體內人參皂苷及生物合成途徑上的關鍵酶基因進行檢測。結果顯示，在中間階段和全開放階段人參皂苷生物合成途徑上的酶基因PgSS 和PgSE 的表達量比閉合階段增加約1. 5 倍，PgDDS 的表達量則增加4 倍以上; 主根和側根中，人參皂苷的含量在葉片開放的中間階段達到最大值，而葉片中人參皂苷的含量在全開放階段達到最高。此外，實時熒光定量的差異表達分析在中藥領域得到廣泛應用，如在甘草、黃花蒿等藥用植物中都有大量的研究。
3. 2 中藥品種及真偽鑒別
中藥的真偽直接影響臨床用藥的準確性和中藥的質量，因此對于中藥品種真偽的鑒別歷來是中藥研究中極為重要的工作。Xue 等依據骨碎補的正品及其混淆品trnLtrnF間隔序列，設計Scorpion 探針，通過實時熒光定量對骨碎補的真偽進行鑒別，同時對多個混合樣品( 正品中加入一種混淆品，按一定比例梯度混合)建立標準曲線，以分析正品中混淆品的摻入量。另外，Xue 等基于升麻及其替代品之間內轉錄間隔區( ITS) 序列的長度、鳥嘌呤( G) 、胞嘧啶( C) 含量的差異，采用LightCycler 定量儀擴增升麻及其替代品的ITS 序列，并分析各產物的熔解曲線。通過解鏈溫度的差異區分鑒別升麻及其替代品，為快速、穩定鑒別升麻及其替代品建立了標準。董玉茹等將限制性內切酶引入熔解曲線分析中，建立了一種新的單核苷酸多態性( SNP) 分型方法，成功實現了對金銀花與山銀花、白術與蒼術品種及真偽的鑒別。此外，有研究者基于實時熒光定量PCR 技術，分別對鐵皮石斛近緣種冒充鐵皮石斛以及三七粉摻假等現象建立快速的檢測方法。
4 小結
植物在生長、發育及受外界環境刺激等過程中，其基因在不同時空的表達存在著很大差異。對基因的表達量進行差異分析，是了解生物體生長、發育和調控等機理的一個重要內容。Northern 雜交、Southern 雜交和原位雜交等都可以用來進行目的基因的定量分析，但這些方法耗時且敏感性較差。普通PCR 終點定量的缺陷是擴增出來的DNA 產物需要通過瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠( EB) 染色后才可以顯示出來，這些步驟耗時且不易精確定量。此外，由于酶動力學的特點，在PCR 反應進程中有基線期、早期指數期、對數-線性期和平臺期，理論上來說，所有樣本的DNA 擴增量最后是相同的，但實際上，不同樣本的平臺期是不一樣的。在這種情況下，通過終點定量分析，反而將反應效率中很小的差別放大出來，造成定量的不準確。實時熒光定量為起始定量，誤差相對較小，這使其在定量方面得到快速的發展。PCR 產物長度或組成不同，其熔解曲線( 熔鏈溫度) 也存在差異，因此可根據熔解曲線的差異進行物種的鑒別。中藥鑒定要解決其中一個很重要的問題就是真偽。實驗過程中，我們可通過設計特異性引物來擴增不同的樣品，從而得到不同的PCR 產物，再根據相應的熔解曲線鑒定中藥材的真偽和摻偽的中藥材。此外，實時熒光定量PCR 還可廣泛用于等位基因分析及轉基因生物檢測等。
實時熒光定量PCR 自建立以來，發展迅速、應用廣泛，擁有許多優點。近年來，許多科研工作者基于實時熒光定量PCR 的基本原理對其進行不斷地研究和改進，使實時熒光定量PCR 得到了進一步的完善。隨著實時熒光定量PCR 的不斷標準化，該技術將在生物學、醫學基礎研究等科研領域中得到更加廣泛的推廣與應用。
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