生物正交氧化還原體系的構(gòu)建及意義論文
細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程除以碳骨架結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹鞯奈镔|(zhì)轉(zhuǎn)化外， 通常還伴隨輔因子介導(dǎo)的能量轉(zhuǎn)移。 物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量轉(zhuǎn)移高度耦合， 顯著增加了代謝系統(tǒng)的復(fù)雜度。 氧化還原輔因子通過(guò)在氧化態(tài)和還原態(tài)之間循環(huán)再生傳遞電子， 將物質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑關(guān)聯(lián)成復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)[1]. 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)， 在微生物中僅吡啶核苷 酸 輔 酶 （nicotinamide adenine dinucleotide（phosphate）， NAD（P））及其還原態(tài)參與的生化反應(yīng)就超過(guò) 1000 種[2], 這還不包括它們參與的其他生物學(xué)過(guò)程。 傳統(tǒng)生物化學(xué)研究提供了大量生物學(xué)元件[3,4],系統(tǒng)生物學(xué)研究建立了各種代謝模型[5,6], 分子生物學(xué)發(fā)展提供了有效的遺傳操作方法， 使設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的高效、受控的物質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑成為可能。 然而， 輔因子在代謝網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)作用使各種生化反應(yīng)建立起復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)， 極大地影響了外源途徑在底盤(pán)細(xì)胞代謝環(huán)境中的功能。 以氧化還原代謝為例，新途徑可能破壞宿主內(nèi)源氧化還原平衡， 從而抑制生長(zhǎng)， 使新途徑難以產(chǎn)生預(yù)期效果[7]. 人工構(gòu)建的外源途徑對(duì)底盤(pán)細(xì)胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的相互干擾， 特別是氧化還原環(huán)境的干擾， 是影響外源合成途徑與底盤(pán)細(xì)胞適配性的重要因素。 通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)輔因子水平， 如控制酶的表達(dá)水平、優(yōu)化代謝途徑、改造酶的輔因子偏好性以及敲除競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑等， 可以?xún)?yōu)化外源途徑與底盤(pán)細(xì)胞的適配性， 在一定程度上提高代謝調(diào)控效率[8~10]. 但輔因子擾動(dòng)的生物學(xué)效應(yīng)的可控性和可預(yù)見(jiàn)性低。 例如， 琥珀酸生產(chǎn)需要維持胞內(nèi)較高 NADH 水平， 但高 NADH 水平影響菌株對(duì)培養(yǎng)條件的適應(yīng)性[11]. 設(shè)計(jì)脂肪酸生產(chǎn)菌株時(shí)需要使脂肪酸合成途徑與宿主 NADPH 供給能力相匹配， 但由于無(wú)法確定擾動(dòng) NADPH 水平對(duì)代謝造成的全局性影響， 無(wú)法預(yù)測(cè)合適的外源基因表達(dá)強(qiáng)度， 需要篩選不同表達(dá)強(qiáng)度的啟動(dòng)子表達(dá)外源基因[12]. 輔因子關(guān)聯(lián)作用導(dǎo)致的復(fù)雜性也是限制代謝途徑可移植性的重要因素。 例如， 在大腸桿菌（Escherichia coli）中構(gòu) 建 的 高 效 丁 醇 合 成 途 徑 , 移 植 到 藍(lán) 細(xì) 菌（Cyanobacteria）中就難以達(dá)到積累丁醇的效果， 因?yàn)樗{(lán)細(xì)菌傾向于積累 NADPH 而非 NADH[13,14].
因此， 提高人工代謝途徑在底盤(pán)細(xì)胞中的適配性、可預(yù)見(jiàn)性和可移植性需要降低代謝系統(tǒng)， 特別是輔因子依賴(lài)型氧化還原系統(tǒng)的復(fù)雜度。
1 正交氧化還原體系
為降低代謝系統(tǒng)復(fù)雜度， 可設(shè)計(jì)獨(dú)立于生長(zhǎng)代謝的合成途徑及獨(dú)立的輔因子循環(huán)再生體系。 這種在復(fù)雜代謝體系中執(zhí)行系統(tǒng)子功能， 并且其執(zhí)行過(guò)程獨(dú)立于系統(tǒng)其他組件的子系統(tǒng)稱(chēng)為正交體系。 正交體系的設(shè)計(jì)構(gòu)建過(guò)程即“正交化”[15]. 正交氧化還原體系是指電子傳遞獨(dú)立于系統(tǒng)其他氧化還原輔因子系統(tǒng)的一種氧化還原體系。 目前主要有兩種策略可用于構(gòu)建正交氧化還原體系： （ⅰ） 在空間上分隔輔因子依賴(lài)型體系， 即“空間正交氧化還原體系”; （ⅱ） 構(gòu)建利用人工輔因子代替天然輔因子的體系， 即“生物正交氧化還原體系”[8,15]. 設(shè)計(jì)構(gòu)建正交氧化還原體系， 是減少外源途徑對(duì)底盤(pán)細(xì)胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾， 提高外源合成途徑與底盤(pán)細(xì)胞適配性的重要策略。 以下綜述正交氧化還原體系的設(shè)計(jì)和應(yīng)用特點(diǎn)。
2 空間正交氧化還原體系
空間正交氧化還原體系通過(guò)將相關(guān)的酶及輔因子限定在特定區(qū)域， 提高局部底物和輔因子濃度、減少或避免與其他子系統(tǒng)的相互作用[16,17], 目前主要通過(guò)構(gòu)建融合蛋白和設(shè)計(jì)蛋白錨定支架實(shí)現(xiàn)， 并已有多個(gè)成功應(yīng)用的報(bào)道。 另外， 最近發(fā)現(xiàn)， 細(xì)胞內(nèi)可形成一些特殊的微區(qū)室（microcompartment）， 可以有效限制輔因子或代謝中間體擴(kuò)散， 從而避免胞內(nèi)輔因子水平干擾微區(qū)室內(nèi)氧化還原代謝[18,19]. 利用微區(qū)室也可構(gòu)建空間正交氧化還原體系[15].
蛋白融合技術(shù)通過(guò)基因工程手段將多個(gè)酶用短肽序列連接形成融合蛋白， 通過(guò)調(diào)整連接肽特性和酶的連接方向控制酶的空間定位（圖 1A）， 優(yōu)化級(jí)聯(lián)催化過(guò)程中底物和能量傳遞[20]. 蛋白錨定支架技術(shù)通過(guò)調(diào)整支架上的錨定位點(diǎn)距離、各種錨定位點(diǎn)的數(shù)量和連接肽特性 3 種方式調(diào)整酶的空間定位和比例（圖 1B）， 可降低代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)目標(biāo)途徑的影響， 提高目標(biāo)途徑底物和輔因子的局部濃度， 減少與環(huán)境的相互影響[21].
兩種空間正交氧化還原體系構(gòu)建策略都受到連接肽特性的影響， 由于連接肽及蛋白結(jié)構(gòu)和功能的多樣性， 需要通過(guò)篩選確定合適的連接肽柔性和長(zhǎng)度， 優(yōu)化酶的空間定位[2,22]. 連接肽通常使用柔性序列 GGGGS（G4S）[23~26], 通過(guò)調(diào)整其拷貝數(shù)改變連接肽長(zhǎng)度， 但有時(shí)利用剛性氨基酸延長(zhǎng)連接肽效果更好， 如將惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）細(xì)胞色素 P450（P450cam）、假單胞氧還蛋白（putidaredoxin,P d X ） 和假單胞氧還蛋白還原酶 （ p u t i d a r e d o x i nreductase, PdR）分別與硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen, PCNA）融合時(shí)， 比較兩組連接肽G4S-（P5）n-G4S（n=1~5）和（G4S）n（n=1~6）效果， 以 G4S-（P5）4-G4S 連接時(shí)活性最高（（6.5±0.3） μmol/（L min））， 而（G4S）n（n=1~6）最高活性（G4S）5約為 5 μmol/（L min）[22].相比于柔性， 調(diào)節(jié)連接肽長(zhǎng)度效果通常更顯著， 上述實(shí)例中最適連接肽長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)活性比 n=1 時(shí)提高兩倍。
長(zhǎng)度選擇也是最常見(jiàn)的連接肽優(yōu)化方式。 在 P450 單加氧酶CinA的C-末端融合黃素氧還蛋白CinC, 催化桉樹(shù)醇轉(zhuǎn)化為 2-羥基-桉樹(shù)醇， 發(fā)現(xiàn)當(dāng)連接肽長(zhǎng)度為10 個(gè)氨基酸時(shí)產(chǎn)量最高， 少于 4 個(gè)氨基酸時(shí)檢測(cè)不到催化活性[2].
除了連接肽特性， 空間正交氧化還原體系構(gòu)建還需要綜合優(yōu)化多種因素以在提高體系獨(dú)立性的同時(shí)獲得更好的催化活性。 構(gòu)建融合蛋白要考慮融合方 向 對(duì) 催 化 效 率 的 影 響 . 將 丙 酮 丁 醇 梭 菌（Clostridium acetobutylicum）來(lái)源的氫酶（hydrogenase,H2ase）融合鐵氧還蛋白（ferredoxin, FD）促進(jìn)產(chǎn)氫時(shí)，用 2 個(gè)氨基酸殘基連接時(shí)， FD 連在 H2ase 的 C-末端對(duì)產(chǎn)氫過(guò)程無(wú)促進(jìn)作用， 而連在 N-末端氫氣產(chǎn)量提高約 3 倍[26]. 這是因?yàn)?H2ase 與 FD 作用位點(diǎn)在氫酶N-末端， N-末端融合更利于兩個(gè)蛋白相互作用。 這種融合蛋白組合的催化效率也受連接肽長(zhǎng)度的影響，以14個(gè)氨基酸殘基連接效果最好， 產(chǎn)氫效率提高近5倍， 延長(zhǎng)至 46 個(gè)氨基酸殘基幾乎沒(méi)有促進(jìn)作用[26].
與蛋白融合技術(shù)相比蛋白錨定支架技術(shù)可更自如地設(shè)計(jì)酶的空間分布和計(jì)量關(guān)系[27,28]. 仍以上述H2ase 與 FD 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫途徑為例： 將真核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的 PDZ（postsynaptic density protein of 95kilodaltons, disc large, zona occludens-1）， SH3（sarcoma homology 3）和 GBD（gelatin binding domain）3 種結(jié)構(gòu)域整合到支架蛋白上， 通過(guò)配體肽段將催化生物合成的酶特異性結(jié)合到支架蛋白的對(duì)應(yīng)位置，這種設(shè)計(jì)可以通過(guò)調(diào)整 H2ase 和 FD 在支架上的結(jié)合位置、酶與支架配體間連接肽的長(zhǎng)度、結(jié)合域數(shù)量等調(diào)整酶的空間分布與比例[26]. 結(jié)合域在支架上間距靠近時(shí)產(chǎn)氫效率高； 結(jié)合域相對(duì)位置相同， FD 與支架蛋配體白的連接肽長(zhǎng)度分別為 10, 20, 40 個(gè)氨基酸時(shí)， 延長(zhǎng)肽鏈長(zhǎng)度可使氫氣產(chǎn)量提高 3~5 倍； 通過(guò)調(diào)整支架蛋白上的 PDZ, SH3 和 GBD 結(jié)合域比例調(diào)整FD:H2ase 比率， 比率越小產(chǎn)氫效率越高[26].
除了蛋白， DNA, RNA 等大分子也可作為蛋白錨定支架[20,29,30], 并且隨著 DNA 合成技術(shù)發(fā)展及對(duì)DNA, RNA 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)能力的提高， 基于核酸的支架受到更多重視。 利用 DNA 整合 NAD（P）H: 黃素單核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）氧化還原酶和熒光素酶， 還原力 NADH 經(jīng)過(guò) NAD（P）H:FMN 氧化還原酶?jìng)鬟f給 FMN, 然后傳遞給熒光素酶， 與分別連在兩條不同 DNA 鏈上的游離狀態(tài)相比， 連在同一 DNA鏈上時(shí)活性提高到 2~3 倍[31]. 支架可以是單個(gè)分子，也可以是可自組裝的蛋白亞基。 如將前述 P450cam,PdX, PdR 和亞磷酸脫氫酶分別與 PCNA 融合時(shí)， 構(gòu)建融合蛋白 PCNA-PdR, PCNA-P450cam 和 PTDH-PCNA-PdX, 3 個(gè)融合蛋白的 PCNA 亞基通過(guò)自組裝形成三聚體將 4 個(gè)酶進(jìn)行空間整合， 促進(jìn)反應(yīng)中的電子傳遞， 組裝復(fù)合體比游離酶催化速率提高 2 倍[22,32].
以上空間正交氧化還原體系的應(yīng)用表明， 通過(guò)減少天然氧化還原體系的干擾， 可以有效提高目標(biāo)氧化還原體系的效率和可預(yù)見(jiàn)性。
3 生物正交氧化還原體系
空間正交氧化還原體系通過(guò)限制環(huán)境因素對(duì)體系的影響提高催化效率和可控性， 仍然難以避免天然輔因子與底盤(pán)細(xì)胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的相互影響。如果突破相應(yīng)生物化學(xué)反應(yīng)對(duì)天然輔因子的依賴(lài)，建立生物正交氧化還原體系， 將可能從根本上解決能量特異性傳遞問(wèn)題。
3.1 生物正交氧化還原體系構(gòu)建
構(gòu)建生物正交氧化還原體系， 需要合成不被天然代謝系統(tǒng)識(shí)別的人工輔因子， 并獲得特異性識(shí)別人工輔因子的突變型酶， 組成具有催化功能的配對(duì)[15,33].利用蛋白工程和化學(xué)生物學(xué)方法， 構(gòu)建獨(dú)立于天然生物反應(yīng)的非天然配體/受體配對(duì)， 即生物正交體系，已取得過(guò)一些降低生物體系復(fù)雜度的成功例子[34,35].
生物正交的配體/受體配對(duì)設(shè)計(jì)策略可分為兩種： （ⅰ）策略以配體改造為中心， 即先改造受體并篩選獲得不識(shí)別天然配體的新受體， 再合成具有一定結(jié)構(gòu)多樣性的配體類(lèi)似物文庫(kù)， 然后篩選得到該新受體與特定配體類(lèi)似物配對(duì)的功能組合； （ⅱ） 策略以受體改造為中心， 即先選定一種不被天然受體利用的配體類(lèi)似物， 再構(gòu)建受體文庫(kù)， 然后篩選得到該配體類(lèi)似物與新受體的配對(duì)功能組合[36].
以設(shè)計(jì)篩選 NAD 類(lèi)似物-依賴(lài)型氧化還原酶為例， 說(shuō)明正交氧化還原體系構(gòu)建過(guò)程[33]. 對(duì)于 NAD分子， 可認(rèn)為由單磷酸腺苷（adenosine monopho-sphate, AMP） 和 煙 酰 胺 單 核 苷 酸 （nicotinamidemononucleotide, NMN） 兩部分組成 （ 圖 2A）， 其中NMN 參與電子傳遞， 而 AMP 部分參與分子識(shí)別， 對(duì)輔因子特異性有重要影響[37]. 改造 NAD 結(jié)構(gòu)的腺嘌呤環(huán)部分， 可在保留電子傳遞功能的同時(shí)改變其與受體相互作用。 因此， 以其他雜環(huán)代替腺嘌呤環(huán)部分合成一系列 NAD 類(lèi)似物， 同時(shí)以 NAD 依賴(lài)型蘋(píng)果酸酶（malic enzyme, ME）為例構(gòu)建其突變體表達(dá)文庫(kù)。 利用以上合成的特定NAD類(lèi)似物為輔因子， 篩選ME突變體文庫(kù)， 得到具有催化活性的功能配對(duì)[33,38,39].
以 5-氟代胞嘧啶環(huán)代替腺嘌呤環(huán)的類(lèi)似物煙酰胺 氟 代 胞 嘧 啶 二 核 苷 酸 （nicotinamide flucytosinedinucleotide, NFCD）（圖 2B）為輔因子， 野生型 ME 催化效率僅為以 NAD 為輔因子時(shí)的 0.93%. 在 ME 突變 文 庫(kù) 中 篩 選 利 用 NFCD 的 突 變 體 ME*（MEL310R/Q401C）， ME*以 NFCD 為輔因子的`催化效率與野生型組合相當(dāng)， 而以 NAD 為輔因子的催化效率僅為以 NFCD 為輔因子的 0.37%. 而且， ME*保留了對(duì)底物蘋(píng)果酸的立體選擇性。 因此， ME*-NFCD 組合可 作 為 生 物 正 交 化 氧 化 還 原 體 系 執(zhí) 行 天 然 的ME-NAD 體系的催化功能[33]. 進(jìn)一步合成了其他NAD 類(lèi)似物（圖 3B）， 發(fā)現(xiàn) ME*與 NBrCD 配對(duì)的催化效率可達(dá)到野生型配對(duì)催化活性的 73%. 表明 NAD類(lèi)似物與 ME*組成的配對(duì)可達(dá)到與天然體系相近的催化效率， 即構(gòu)建了不依賴(lài)天然輔因子的正交氧化還原體系[39].
基于NFCD類(lèi)似物（NFCD analog, NXCD）的正交氧化還原體系構(gòu)建策略具有可擴(kuò)展性。 氧化還原酶與 NAD 的結(jié)合區(qū)域通常具有保守的 Rossmann 折疊結(jié)構(gòu)[40]. ME*的關(guān)鍵突變位點(diǎn) L310 位于其保守序列GX（X）GXXG 的 N-末端， 對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的相應(yīng)保守位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變， 均獲得了偏好 NFCD 的突變體[33]. 說(shuō)明同樣的突變策略可應(yīng)用于改造其他吡啶核苷酸輔酶依賴(lài)型氧化還原酶， 構(gòu)建相應(yīng)的正交反應(yīng)體系。
構(gòu)建生物正交氧化還原體系的難點(diǎn)在于設(shè)計(jì)篩選生物正交的配體-蛋白組合。 雖然不斷完善的配體-蛋白組合輔助設(shè)計(jì)工具降低了工作難度[41~43], 獲取高活性配體-蛋白組合仍需高通量篩選策略[44]. 由于氧化還原酶具有較高的結(jié)構(gòu)保守性[40], 識(shí)別 NAD 類(lèi)似物所蘊(yùn)涵的信息可用于指導(dǎo)改造其他氧化還原酶。 目前使用的 NXCD 系列類(lèi)似物合成成本較高， 使用過(guò)程中可以選擇循環(huán)再生策略降低使用成本[33].
3.2 生物正交氧化還原體系的應(yīng)用
由于正交氧化還原體系獨(dú)立于天然輔因子循環(huán)體系， 可進(jìn)行途徑特異性還原力傳遞， 因此理論上可用表達(dá)突變型功能酶的粗酶液進(jìn)行選擇性生物轉(zhuǎn)化。
以大腸桿菌細(xì)胞裂解液催化轉(zhuǎn)化蘋(píng)果酸生產(chǎn)丙酮酸為例， 對(duì)于表達(dá)野生蘋(píng)果酸酶的體系， 在 NAD 存在下， 蘋(píng)果酸氧化脫羧生成丙酮酸并伴生NADH[45]. 而內(nèi)源的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）以NADH 為輔因子， 進(jìn)一步將丙酮酸還原為乳酸（圖3A）。 丙酮酸和乳酸收率分別為 70%和 26%, 即 26%丙酮酸被轉(zhuǎn)化成乳酸。 而利用過(guò)表達(dá) ME*的粗酶液在外加 NFCD 的條件下， 丙酮酸收率達(dá)到 79%時(shí)， 乳酸收率僅為 5%. 這是因?yàn)椋?內(nèi)源乳酸脫氫酶難以利用 NFCDH 為輔因子還原丙酮酸（圖 3B）。
可見(jiàn)， 利用生物正交氧化還原體系， 可以使電子特異性地在該體系內(nèi)部傳遞， 避免與內(nèi)源途徑相互干擾， 提高體系效率的同時(shí)排除副反應(yīng)。 這一特性表明正交氧化還原體系可降低外源途徑與底盤(pán)細(xì)胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的相互干擾， 提高外源合成途徑與底盤(pán)細(xì)胞適配性。 由于目前還沒(méi)有在胞內(nèi)檢測(cè)到NXCD 的相關(guān)報(bào)道， 應(yīng)用正交氧化還原體系需要解決將 NXCD 導(dǎo)入胞內(nèi)的問(wèn)題。 通過(guò)化學(xué)合成獲得NXCD, 再利用細(xì)胞透性化技術(shù)或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[48~50]可將 NXCD 導(dǎo)入細(xì)胞。
作者近期利用擬南芥（Arabidopsis thaliana）來(lái)源的 NAD 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[50]將胞外 NCD 導(dǎo)入大腸桿菌工程菌， 成功地在胞內(nèi)構(gòu)建生物正交氧化還原體系[51]. 該體系利用突變型亞磷酸脫氫酶氧化亞磷酸再生NCDH, NCDH 特異性推動(dòng) ME*催化丙酮酸還原羧化產(chǎn)生蘋(píng)果酸[51,52]. 而對(duì)于天然體系， 由于 NADH 被天然代謝系統(tǒng)消耗， ME利用NAD催化蘋(píng)果酸氧化脫羧反應(yīng)。 這些結(jié)果表明， 基于 NCD 的正交體系可有效避免與天然體系相互干擾， 選擇性傳遞氧化還原力。正交氧化還原體系的應(yīng)用將顯著提高外源合成途徑與底盤(pán)細(xì)胞適配性。
4 展望
正交氧化還原體系對(duì)提高輔因子調(diào)控效率和可預(yù)見(jiàn)性具有重要意義， 有利于提高外源合成途徑與底盤(pán)細(xì)胞適配性。 可通過(guò)空間正交化和生物正交化兩種策略構(gòu)建正交氧化還原體系。 其中空間正交化策略在空間上隔離輔因子依賴(lài)型代謝反應(yīng)， 其推廣應(yīng)用依賴(lài)于發(fā)現(xiàn)更高效的蛋白錨定支架系統(tǒng)或組裝新的微區(qū)室。 生物正交化策略可從根本上解決輔因子依賴(lài)型反應(yīng)相互干擾的問(wèn)題， 是輔因子調(diào)控技術(shù)發(fā)展的重要方向， 其發(fā)展依賴(lài)于分子間相互作用的分析設(shè)計(jì)能力和配體/受體組合的篩選能力， 以獲得功能更豐富的生物正交氧化還原體系， 并提高生物正交特異性。 其中在 NCD 基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)煙酰胺胞嘧啶二 核 苷 酸 磷 酸 （nicotinamide cytosine dinucleotidephosphate, NCDP）化學(xué)合成或生物合成途徑， 并篩選構(gòu)建 NCDP-功能酶正交組合， 將極大地提高生物正交氧化還原體系組件的設(shè)計(jì)構(gòu)建效率， 提供多種輔因子水平和氧化還原狀態(tài)選擇， 為基于生物正交氧化還原體系的代謝途徑設(shè)計(jì)提供更廣闊的應(yīng)用和研究空間。
正交氧化還原體系提供了一種提高胞內(nèi)輔因子調(diào)控效率和可預(yù)見(jiàn)性的新思路， 與其他工程策略組合使用， 對(duì)設(shè)計(jì)微生物細(xì)胞工廠乃至生命系統(tǒng)具有重要價(jià)值。
參考文獻(xiàn)
1 Wang Y, San K Y, Bennett G N. Cofactor engineering for advancing chemical biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24: 994–999
2 Belsare K D, Ruff A J, Martinez R, et al. P-Link: a method for generating multicomponent cytochrome P450 fusions with variable linkerlength. Biotechniques, 2014, 57: 13–20
3 Way J C, Collins J J, Keasling J D, et al. Integrating biological redesign: where synthetic biology came from and where it needs to go. Cell,2014, 157: 151–161
4 Slusarczyk A L, Lin A, Weiss R. Foundations for the design and implementation of synthetic genetic circuits. Nat Rev Genet, 2012, 13:406–420
5 Orth J D, Conrad T M, Na J, et al. A comprehensive genome-scale reconstruction of Escherichia coli metabolism-2011. Mol Syst Biol,2011, 7: 535
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